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  大肠杆菌酶联免疫反响测验盒 1．概述 大肠杆菌O157:H7酶联免疫检测验剂盒是用来检测食物和饲料中大肠杆菌O157:H7的含量。大肠杆菌O157:H7是肠杆菌宗族的一种革兰氏阴性菌，“O”指的是菌体抗原，“H”指的是鞭毛抗原，这是大肠杆菌数以百计血清型中的一种。大多数片段是无害的，一般存在在哺乳动物的肠中。这个O157:H7片段能发生志贺祥毒素，是肠出血性大肠杆菌（EHEC）级的一个成员，会导致严峻的疾病，感染上肠出血性大肠杆菌的人会呈现肠出血症和溶血性尿毒综合症。污染致病原首要存在于：生的细纹牛肉、未经巴氏消毒的牛奶、未经处理的水、果汁、嫩芽、生菜和腊肠中。 检测食物中大肠杆菌O157:H7既吃力又费时。REAGEN大肠杆菌O157:H7酶联免疫检测验剂盒为国家管理部分、食物生产商、质检部分供给了便利有用的办法，检测水平为105细胞/ml。 2．试剂盒原理 该试剂盒根据酶联免疫检测原理，大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体包被在微孔内。剖析过程中，假如样品中有大肠杆菌存在，当参加样品时，即可与单抗结合，在孔中参加恰当的培育液可以敏捷增菌。酶符号的二抗与板孔中包被的一抗结合，参加底物后色彩的深浅与样品中大肠杆菌O157:H7的含量相关。 3. 试剂盒组成 试剂盒组成 规范 保存 抗体包被的酶标板 12×8 孔 2-8°C 1×阴性对照 1×1ml -20°C 1×阳性对照 1×1ml -20°C 50×HRP- 二抗 3×50l -20°C 二抗稀释液( 1×20ml 2-8°C 20×浓缩洗液 1×30mL 2-8°C 停止液 1×20mL 2-8°C TMB底物 1×10mL 2-8°C 4. 检测限：105细胞/ml 5. 穿插反响： 本试剂盒可检测大肠杆菌O157:H7抗原 6．其他需求而本试剂盒未提的设备或资料 酶标仪（450nm） 恒温培育箱 漩涡振动器 移液器(10、20和100L，1mL各一支) 多道移液枪：50-300l（可选择） mTSB培育基：含有10g/L酪蛋白氨基酸和1.5g/L磷酸氢二钾的胰化酪蛋白大豆培育基 7.留意事项 试验前请阅览以下文字，以确保取得**试验作用。 样品中含有大肠杆菌，请当心运用。 进行样品预备过程中，操作人员必定有好的微生物操作技能。 不要运用过期的试剂盒。 不同批次的试剂盒不要混用，确保二抗正确稀释。 尽可能坚持室温20-25℃，避免在通风口操作避免温度过低，过热和/或许蒸腾。不要在阳光直射下试验，避免过热及蒸腾。在孵育期间，假如作业台温度过低，应该衬托纸巾或其他物料。 水质量很重要，确保运用蒸馏或许去离子水。 参加样品或许试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔挨近底部，并坚持触摸。 孵育时刻的核算越规范越好，坚持增加规范品的一致性，先增加规范品后增加样品。 从低浓度到高浓度地增加规范品，下降影响规范品曲线质量的危险。 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。 8．肉样品的制备 25g肉样品均质2分钟并在225mL mTSB培育基中120rpm 37℃下培育过夜， 取出1mL培育基， 121℃高温灭菌或许煮沸20分钟。使样品冷却回复到室温，混匀后可以用大肠杆菌O157:H7试剂盒进行细心的检测。 9．酶联免疫反响测验过程 试剂的预备 一切的试剂在运用之前应将其回温至室温，并在运用试剂前摇摆几下，以确保合理的浓度。预备所需满意量的试剂，不要将装备的试剂倒回原试剂瓶中，在操作试剂时主张一次性运用下降污染程度。 （1）1×HRP-二抗作业液 按1：49的份额装备50×HRP-二抗和二抗稀释液 （2）1×作业洗液 按1：19的份额装备20×浓缩洗液和蒸馏水 检测过程 以下为核算份量的表格，用户可通过你自己的需求来承认需求装备多少试剂。 试剂 每个反响需求的体积 1×阴性对照 50L 1×阳性对照 50L 1×HRP-二抗 50L 1×洗液 2.0ml 停止液 100L 底物 100L 取出需求的板孔，别离参加50l的阴性对照、阳性对照于所设定的孔中 参加50l 样品于所设定孔中 室温25℃下避光孵育30分钟 每孔参加1×洗液300l 洗板3次，zui后一次洗板后倒置铲除板中剩余水分，可用吸水纸吸干（不允许在洗板后，下一步操作前将板孔风干） 每孔参加50l 1×酶标二抗，25℃下避光孵育30分钟 每孔参加1×洗液300l洗板3次，zui后一次洗板后倒置铲除板中剩余水分 每孔参加100l TMB底物，悄悄振动混匀，25℃室温下避光孵育15分钟。 每孔参加100l停止液停止反响。 在参加停止液后尽可能快的用450nm酶标仪读取板孔读数 10．成果剖析 （1）视觉断定成果 参加停止液前需视觉断定 阳性对照：蓝色 阴性对照：无色或浅蓝色（挨近无色） 如呈现下述现象样品中就含有大肠杆菌 1）阴性对照为无色或淡蓝色，阳性样品色彩显着深于阴性对照 2）阳性样品色彩一般显着深于阴性对照，可是不用必定和阳性对照色彩相同 如呈现下述现象样品即为阴性 1）阴性对照为无色或淡蓝色 2）样品的色彩和阴性对照色彩相同或十分挨近 （2）OD值断定 酶标仪450nm处读取样品吸光值 阴性对照：450nm下读数小于0.4，不然阐明洗板不完全 阳性对照：450nm下读数大于1.0 假如两个对照没有满意以上条件，试验需重做 阴性样品：OD（450nm）＜0.6 阳性样品：OD（450nm）≥0.6 留意：样品的断定需求在对照符合规定规范的条件下才可以进行 用试剂盒检测出的可疑阳性样品若想进一步承认，主张如下： 取没被加热的阳性样品培育基接种到含5溴基-4氯基-3吲哚基-b-D葡萄糖苷酸山梨酸琼脂（Mac Conkey’s sorbitol agar）上再次进行培育，然后再接种到碱性亚甲蓝琼脂上。承认的大肠杆菌O157:H7可以终究靠凝聚试验与O157抗体结合而被判定出。