球友会体育直播:

  开发像Lbr-6108这样的菌株作为心理生物来调节神经兴奋-抑制平衡、调节情绪、认知功能、学习和记忆过程，可能有希望作为心理健康管理的补充补救措施。

  背景：在人类的许多神经递质中，γ-氨基丁酸（GABA）显示出具有改善几种心理健康指征（如压力和焦虑）的潜力。由于肠道内微生物分泌的GABA可影响宿主心理健康的预后，因此微生物-肠-脑轴是GABAergic能效的重要方法。了解肠道内微生物产生GABA的分子特征，可以为心理健康的新疗法提供见解。

  结果：在添加谷氨酸钠（MSG）的典型合成生长培养基中，对3株具有同源性谷氨酸脱羧酶（GAD）操纵子的Levilactobacillus brevis的整体生长情况、谷氨酸利用和GABA产生进行了评价。Levilactobacillus brevis Lbr-6108™（Lbr-6108，之前称为L. brevisDPC 6108）和Levilactobacillus brevisLbr-35™（Lbr-35）具有相似的生长特征，但在GABA分泌和耐酸性方面存在非常明显差异。Lbr-6108在生长期早期阶段就能够产生GABA，在生长达到稳定期后期产生的GABA明显高于Lbr-35和模式菌株Levilactobacillus brevisATCC 14869。通过RNA测序我们鉴定了GABA产生过程中几个时间点的全基因表达情况。负责GABA产生和分泌的GAD操纵子，在发酵仅6 h后在Lbr-6108中被激活，并持续到整个稳定期。此外，Lbr-6108同时激活了许多不同的耐酸性机制，这赋予了其酸耐受性和能量的产生。相反，在遗传学上具有类似GAD操纵子的Lbr-35（包括GAD基因的两个拷贝），即使与MSG共同培养，也未表现出GAD操纵子的上调。

  结论：本研究首次评价了Levilactobacillus brevis在不同生长期GABA产生过程中的全转录组变化。多种耐酸机制的共同表达揭示了人类共生菌之间的特殊生态位的代谢功能，并强调了GABA代谢在这一重要微生物物种中的复杂调节作用。此外，Lbr-6108增加和快速的GABA产生突出了该菌株作为治疗药物的潜力和筛选微生物效应分子输出的总体价值。

  译名：转录组学揭示了Levilactobacillus brevis的耐酸性和产γ-氨基丁酸（GABA）的不同代谢策略

  1LevilactobacillusLbr-6108、Lbr-35和ATCC 14869的基因组分析显示GAD操纵子的同线 bp和2,473,148 bp。Lbr-35的新基因组草图为6个连续序列，总大小为2,338,793 bp，其中G + C含量为46.1%。Lbr-35基因组注释揭示了2,328个编码区、62个tRNA、15个rRNAs和15个间隔区的单个CRISPR重复间隔区阵列。利用所有公开的基因组进行系统发育学分析，我们得知了L. brevis的3个主要分支（图1A）。Lbr-6108和ATCC 14869均属于同一分支的粪便分离株，而Lbr-35处于单独的菌株群中。Lbr-35是一种商业益生菌，其分离来源尚不清楚，然而，它与L.brevisHQ1-1类群（分离自传统乳制品）最为相似。这3株L. brevis菌株共享了2,029个基因，Lbr-6108在额外的近500,000 bp的基因组区域中存在有697个独特基因。Lbr-6108和Lbr-35之间共享了38个基因，而Lbr-6108和ATCC 14869之间共享了261个基因（图1B）。较大的Lbr-6108基因组描述了一个或多个大质粒和许多独特的基因，如原噬菌体相关蛋白和从头脂肪酸生物合成的基因以及一些调节因子和磷酸转移酶摄取系统的基因。

  已有的研究证明了L. brevis是唯一可编码两个GAD基因的菌株。事实上，本研究所涉及的三种L. brevis菌株都含有gadA和gadB的拷贝。gadB基因与转录调节因子（gadR）、谷氨酸/γ-氨基丁酸逆向转运蛋白（gadC）和谷氨酰-tRNA合成酶（gltX）共同存在于GAD操纵子中，而gadA基因是一个独立的基因（图1C）。

  采用相同比较方式对Lbr-6108和ATCC 14869和进行比较发现，gadR、gadC和gadB存在单一突变。Lbr-6108gadA蛋白序列与Lbr-35和ATCC 14869的同源性分别为98.9%和99.8%。在Lbr-6108中，预测了gadR直接上游基因间的三个启动子区域。Lbr-35中三个启动子区域中的两个的基因间序列具有高度多态性，这可能会影响GAD操纵子的整体表达。

  在Lbr-6108培养6 h时就检测到了GABA的产生，其浓度可达66 µg/mL，在该菌株生长达到稳定期附近时（15 h）可检测到最大值产生量--520µg/mL

  Lbr-6108产生的GABA与MRS中初始谷氨酸的快速消耗相关。谷氨酸盐初始浓度在650-700 µg/mL范围内（0.065-0.07%），前15 h可被Lbr-6108快速利用至100 µg/mL左右，从而显示有86.0%的谷氨酸转化为产生的GABA（图2A）。此外，在培养基中以谷氨酸钠的形式加入10,000 μg/mL（1.0%）游离谷氨酸底物后，Lbr-6108所产生的GABA含量有所增加（图2A）。与未添加谷氨酸的培养条件相比，谷氨酸的添加使得GABA的产生量在15 h时增加了2.5倍，在培养结束时（48 h），对培养基中过量的谷氨酸进行定量不难发现，有97.0%的谷氨酸被转化生成了GABA，产生了约10倍以上的GABA（图2A）。菌株利用谷氨酸的GAD酶活性在24 h时达到最大值，该时间点GABA的产生比21 h时增加了39.2%（图2A）。在MRS + MSG培养条件下，在培养48 h时，GABA的最终浓度为6,000 μg/mL，这与之前Lbr-6108的测量值相似。我们通过在培养集中补充更多的底物（MSG），进一步探究了Lbr-6108利用谷氨酸产生GABA的生产能力。当培养基中谷氨酸的浓度从10,000 μg/mL（1%）增加到30,000 μg/mL（3%）甚至是90,000 μg/mL（9%）时，增加了Lbr-6108产生GABA的量。添加1.0%的MSG在48 h时产量约是24 h时的一倍，而3%和9% MSG添加量的产量分别比24 h时增加了243.0%和607.0%（表S2，图2E）。随后，尽管GABA的产生在72 h时仍在增加，但Lbr-6108似乎减弱了对谷氨酸盐的利用率。基于GABA产量与利用的谷氨酸之间的比值，我们计算了GABA的产率，通过比较我们得知，10,000 μg/mL MSG添加量的GABA产率普遍较高，并且随着培养时间的延长而持续增加

  （表S2，图2E）。24 h所有培养基条件下培养基的pH值为5（空白培养基pH 5.5-6），而48 h时，10,000 μg/mL MSG添加量的培养基的pH值仍保持在5左右，但此时30,000 μg/mL和90,000 μg/mL MSG添加量下培养基中的细菌培养物分别增加至7和8。对0 h、24 h和48 h时直接收获的细胞菌体进行菌株特异性PCR和16S测序，以确保收获的菌株为纯菌株。通过鉴定我们在Lbr-6108和Lbr-35之间未观察到污染现象（图S1）。

  在MRS和MRS + MSG两种培养条件下，Lbr-6108是唯一在早期生长阶段（6 h）就能产生可检测到GABA含量的菌株

  Lbr-35在MRS和MRS + MSG生长的稳定期至稳定后期的GABA浓度较低，其可归因于有效的谷氨酸利用（最大利用率为20.0%）（图2B）。对于ATCC 14869而言，其在MRS或MRS + MSG中的生长模式与Lbr-6108和Lbr-35明显不同，ATCC 14869产生的GABA与Lbr-35所产生的GABA相当，但仅在24-48 h之间才可观察到可检出的GABA（图2 C）。由于Lbr-6108和Lbr-35具有相似的生长特征，但具有不一样的GABA产生能力，因此我们对这两种菌株进行了RNA测序。而本研究并没有对ATCC 14869进行测序，其原因是因为它较慢的生长模式有可能影响GAD操纵子的表达结果。4 Lbr-6108在发酵早期表达GABA产生的基因

  主成分分析中代表了两种菌株基因表达的趋势，其中同一菌株的重复样本多聚集在一起（图S2）。然而，对于在MRS + MSG培养条件下的Lbr-35菌株来说，其在6 h和12 h时各有一个样本聚集在一起，而并没有与各自的重复样本聚集在一起。在Lbr-6108中，18 h时的基因表达差异最大（表1）。对于该菌株来说，在MRS + MSG培养条件下，其18 h的样本与12 h的样本的基因表达更为相似，而在MRS培养条件下，其18 h的样本与24 h的样本更相似（图S2）。图3显示了Lbr-6108和Lbr-35在不同生长阶段的显著差异表达基因（DEGs）情况。一般而言，DEG的数量跟着时间的推移而增加，与6 h相比，两种菌株在24 h时均观察到最大数量的DEGs

  （图3A-B）。无论是在MRS还是在MRS + MSG的培养条件下，在较早生长期（12 h与6 h相比），Lbr-6108均表现出比Lbr-35更多的DEGs（图3C–F）。再者，在Lbr-6108的对数生长中期（12 h），有14个基因在MRS + MSG中差异表达，而对Lbr-35来说，相同时间点MRS + MSG仅诱导了2个DEGs（图3E）Lbr-6108的14个基因由糖发酵的假想蛋白、转运蛋白和其他酶，以及吡哆醛-5′-磷酸（PLP）操纵子中的thiD2组成，这

  突出了菌株之间一般生长特性的细微表达差异，尽管他们具有相似的生长模式（图2A-B）。

  虽然是在生长模式相似的时间点下进行采样，但GAD操纵子的调控在Lbr-6108和Lbr-35之间的差异很大

  gadB的基因表达倍数变化在MRS和MRS + MSG中分别明显地增加了2.47倍和3.28倍（图4A）。而gadA表达在任何时间点之间都没有显著变化，这表明gadB是Lbr-6108中主要的谷氨酸脱羧酶（图4A）。gadB的表达在18 h时持续增加而在24 h时下降（图4A）。正如预期的那样，gadC基因在整个实验过程中表达的增加与gadB相似，其在MRS + MSG培养条件下的表达是MRS培养条件下表达的近两倍（图4A）。gadR在MRS培养条件下从12 h-18 h上调了几乎2倍，而在MRS + MSG培养条件下上调4倍以上（图4A）。重要的是，催化吡哆醛磷酸化形成PLP的thiD家族吡哆醛激酶基因thiD2的表达增加与GAD操纵子相似，证实了Lbr-6108产生GAD催化功能所需的辅因子PLP的能力（图4B）。有趣的是，RNA表达图谱表明，由于gadR、gadC、gadB和gltX具有相似的读段覆盖度，并维持在所有基因中，因此这些基因都是共转录的（图5A）。正是由于GAD操纵子的cDNA read覆盖开始于gadR上游的预测启动子区域，从RNA测序数据中我们观察到GAD操纵子预期的表达模式（图5B）。

  由于GAD操纵子与Lbr-6108的高度同源性（图5C），这使得GAD操纵子的一些活性在Lbr-35中是可以预期的，但令我们惊讶的是，处理18 h和12 h时MRS培养条件下、以及18 h时MRS + MSG培养条件下gadA的表达有所下调外，从6 h-24 h期间并无其他显著改变（图4A）。

  在MRS培养基中无论是不是额外添加MSG，Lbr-35中GAD操纵子的表达模式都未表现出差异。

  在MRS + MSG培养条件下或仅MRS培养条件下培养的Lbr-35中分别发现了18个（图3C）和51个（图3B）DEGs在菌株生长的对数中期（T12、T18和T24）的所有时间点差异表达。在这些DEGs中，胍丁胺脱胺酶途径中的基因，包括胍丁胺脱胺酶aguA（EC 3.5.3.12）和胍丁胺/腐胺反向转运蛋白aguD，在Lbr-6108和Lbr-35中均上调（图4C）。在Lbr-6108中，精氨酸脱胺酶操纵子在MRS和MRS + MSG中均仅在生长的24 h时高表达（图4D）。在MRS + MSG培养条件下培养18 h时，Lbr-6108中GAD操纵子的表达最高，而Lbr-35却显著表达多个噬菌体溶酶体相关基因、转运蛋白的基因和三个促聚集因子（表1）。

  在Lbr-6108中，MRS和MRS + MSG在对数中期（12 h）至静止期（24 h）之间分别有153和117个DEGs（图3）。在MRS中发现的这153个DEGs中，有一部分是高表达精氨酸脱胺酶操纵子的基因，这中间还包括精氨酸/鸟氨酸反向转运蛋白arcD、鸟氨酸氨甲酰基转移酶argF（EC 2.1.3.3）和精氨酸脱胺酶arcA（EC 3.5.3.6）（图4D）。已知苹果酸乳酸发酵可降低酸度，实际上，在Lbr-6108培养过程中的不同时间点，其苹果酸乳酸酶mleS基因也确实在增加（图4E）。在MRS和MRS + MSG培养条件下，苹果酸发酵操纵子的苹果酸渗透酶mleP在12 h时均轻微上调（图4E）。有必要注意一下的是，在酪氨酸脱羧酶操纵子中，仅酪氨酰-tRNA合成酶基因tyrS表现出较高的诱导率，而在任何试验菌株或条件下的任何时间点均未诱导酪氨酸脱羧酶基因tdcA。此外，精氨酸脱胺酶通常被上调，其上调程度在两种培养基中相当（图4D）。重要的是，在MRS和MRS + MSG两种培养条件下，其上调的许多基因与Lbr-6108中不同的抗酸机制相关。一般而言，Lbr-6108中L-和D-乳酸脱氢酶基因未显著上调或下调，这表明培养物中有稳定的乳酸生成。

  由于其中许多代谢基团参与酸性的耐受性调控，因此相比于Lbr-35，我们对Lbr-6108的耐酸性增加进行了测试。在活细胞计数前，将两种菌株暴露于酸化培养基不同时间。在pH=3的基础培养基中暴露3h后，尽管Lbr-6108的活细胞计数较初始浓度有所降低（ 1.0%），但并未表现出统计学差别。相反，在相同的暴露参数下，Lbr-35活细胞下降明显（图6）。进一步，个人会使用不含碳水化合物的盐基培养基以探究耐酸性是否是由于基础培养基中碳水化合物、氨基酸、肽或其他营养的东西的摄取增加所致。我们得知，尽管Lbr-6108的活细胞数量明显高于Lbr-35，但在相同pH强度下的盐水培养基中暴露时，两种菌株均出现显著的情况（图6）。这表明Lbr-6108通过代谢碳水化合物诱导了其耐酸性。

  虽然GABA在菠菜、大麦和豆芽（300-720 nmol/g干重）等植物性食物中相对丰富，但基于某一些安慰剂对照研究不难发现，含有GABA的食物不能够满足消费者的需求。对过去使用天然或生物合成GABA的临床试验的系统回顾表明，有效剂量的应力减低在2.01-100 mg范围内，而并非一个标准值，较低剂量影响自主标记物，较高剂量影响中枢标记物，并且为了达到疗效，需要延长摄入而不是单次给药。这强调了可定期食用的GABA安全来源的重要性。包括LAB在内的微生物是GABA的重要来源，LAB中（如乳酸杆菌）GABA的产生能力因种属和菌株而异。最近已分离出高产GABA的乳酸杆菌菌株，可满足那群消费的人需求。本研究中，我们试图在Levilactobacillus brevis中进一步探究产GABA的菌株特异性机制。

  GABA的增加与实验中谷氨酸浓度的降低相一致。MRS中（生长实验中使用的合成培养基）固有的谷氨酸浓度与谷氨酸的平均日摄入量相似（肉食者、鱼肉食者、素食者和纯素食者约为15 g）。MSG作为是谷氨酸的钠盐，在商业中大范围的应用，其在美国和欧洲的平均每日消耗量约为0.6 g（0.3-2.0 g/天），是东亚和东南亚国家的2-3倍。谷氨酸盐作为兴奋性神经递质发挥作用，但过量的谷氨酸盐可能会引起其结合的细胞内兴奋反应增加，从而在称为“兴奋性毒性”的过程中导致细胞死亡。在实际生活中，欧盟所规定其食品中的谷氨酸的终浓度不应超过10 g/kg。因此，尽管谷氨酸钠有益于食品制造业，但这种食品添加剂的普遍使用可能对公共卫生产生有害的后果。由于平均健康成人的平均胃肠道通过时间约为30 h，因此Lbr-6108中GAD操纵子的快速激活可能允许饮食中的谷氨酸钠在体内有益地转化形成GABA。生长和RNA测序实验证实，与具有相似生长模式的菌株或具有同源性GDA操纵子的其他两种菌株相比，Lbr-6108能够产生更多的GABA，并且其GAD操纵子相应的上调。

  Lbr-35被用作阴性对照来评估最近综述的各种转录组策略，这些策略能够适用于解释GABA产生的差异。两种GAD基因在L. brevis中的同时表达会增加GABA的产生，但只有gadB基因在Lbr-6108中表现出不同的表达。最近的一项研究表明，中国清香型白酒中分离出的L. brevis分离株，其GABA产生的增加可部分归因于gadR基因的过表达。同样，增加gadC的表达允许更多的底物从细胞外环境转入到细胞内。此外，PLP操纵子的上调确保了足够的辅因子可用于脱羧过程。GAD操纵子中基因在Lbr-6108中的表达随着谷氨酸浓度和时间的推移而波动。对这些假设中的任何一个做评估都可用于解释为什么Lbr-6108比Lbr-35具有更多的产GABA能力，但却无法解释Lbr-35与Lbr-6108差异如此之大是直接遗传或转录组所导致的。

  即使外加补偿谷氨酸钠，在Lbr-35培养过程中，其GAD操纵子的表达也没有增加，gadA在Lbr-6108或Lbr-35的任何条件下都没改变表达。这两种菌株均没有gabT同源物，尽管整体序列具有同源性，但gltX仅在Lbr-6108中增加。有趣的是，在仅MRS的培养条件下这两种菌株中PLP操纵子中thiD2基因的表达相似，但在加入谷氨酸钠后，Lbr-6108菌种中PLP操纵子中thiD2基因的表达明显地增加。未来的研究直接定量L. brevis中的PLP将有利于进一步分析其转录影响。在Lbr-6108的GAD操纵子上游鉴定出一个假定的启动子区域能增加GAD操纵子的表达，但还要进一步的分析。综上，这强调了乳酸杆菌中GABA整体调控的复杂性。RNA测序也揭示了Lbr-6108中与GAD操纵子同时激活了其他几个耐酸途径。

  GABA的快速产生伴随着其他几种耐酸机制的激活，包括精氨酸脱胺过程和苹果酸发酵过程。这些过程不仅对耐酸性很重要，而且对能量的产生同样重要。人们很容易推测，从婴儿粪便菌群中分离出来的Lbr-6108，代表了复杂的婴儿肠道菌群，习惯于能量和底物清除，因此它在生长期早期或静止期激活了多种策略，例如精氨酸操纵子。另一方面，正是由于GABA被证明是不可培养的人类微生物的必需生长因子，这可能有助于增加婴儿微生物群中的共生生物的生长。相反，Lbr-35可能习惯于在资源有限的食物环境条件下进行调控，只会在严重的酸应激或能量饥饿时产生过量的GABA。但目前仍要进一步的实验来评估GABA的产生作为一组不同资源获取策略副产物的这一假设。尽管Lbr-35与Lbr-6108具有相似的生长模式，但在对生长培养基中谷氨酸盐的响应方面，这两种菌表现出出相当大的差异。

  最近的研究表明，L. brevis中GABA的产生并不取决于其最佳的生长条件，不同的碳水化合物可能会增加Lbr-35中GABA的产生。本研究中我们得知，在MRS培养基中，无论是不是存在MSG，Lbr-35中GAD操纵子中的基因都没有显著表达。在Lbr-35 RNA测序中所发现的上调的抗酸代谢途径仅是胍丁胺代谢，其在加入10,000 μg/mL MSG后代谢增加。胍丁胺与GABA一样，是细菌使用的替代氮源，也是腐胺的前体，腐胺是葡萄酒中含量最丰富的生物胺。此外，Lbr-35表达与应激反应的基因相关，这些基因包括促聚集因子（APFs），这是一个已被证明是益生菌乳酸杆菌的理想特征的，其有助于竞争性排除病原体。此外，

  APFs的上调对于生物膜的形成很重要，有助于胃/小肠液的存活和与上皮细胞的粘附。这在某种程度上预示着Lbr-35激活了对发酵胁迫的替代反应，这些激活的胁迫反应聚焦于聚集和生物膜形成，而非Lbr-6108中的营养代谢和去酸化反应。虽然GABA产生的菌株特异性策略是许多研究的主旨，但低GABA产生菌株的功能分析也值得进一步研究。像Lbr-6108这样子就能够快速并增加GABA产生的微生物对宿主微生物-肠-脑轴具有益处。已有研究证明了肠道微生物在大脑的正常发育发育、功能、生理和行为中具有十分重要的作用。事实上，产GABA的齿双歧杆菌ATCC 27678（Bifidobacterium dentium ATCC 27678）降低了大鼠的内脏的超敏反应。已有的的研究表明，产生GABA的鼠李糖乳杆菌JB-1（Lacticaseibacillus rhamnosusJB-1）可以通过调节GABAergic系统降低脑中应激诱导的生物标志物。有趣的是，在迷走神经切断术后，对焦虑相关行为的影响停止，这表明微生物产生的GABA通过迷走神经介导了对大脑的直接影响。

  除了对应激相关行为和脑功能的影响外，微生物GABA的产生还与记忆和睡眠质量的改善相关。由于许多使用典型益生菌物种的研究显示了与肠-脑轴相关的益处，而在这些研究中并没有关注到GABA的作用，这表明沿着微生物-肠-脑轴的交流不仅是由微生物-GABA产生介导所导致的。筛选新型益生菌的最佳效应因子功能能增加健康益处的可能性和影响。事实上，Lbr-6108针对其他肠道细菌分离株进行了高GABA输出筛查，并在体外和啮齿类动物中显示出多种健康获益。在基因组修饰尚未被广泛采用的应用中，天然产生大量的效应分子（如GABA）并被认为是安全的，同时也是生物体补充溶液的主要候选者。

  在本研究中，生理相关实验室条件下的RNA测序被用来评估GABA产生的整体调控。这揭示了Levilactobacillus brevisGAD操纵子的转录并不仅仅取决于gadR的存在，由于具有相似GAD操纵子序列的菌株在相同条件下不会产生GABA。

  因此，高GABA产生，特别是在生长期早期，被证实具有菌株特异性。在确定了Lbr-6108的高产GABA能力后，有必要进一步探究微生物对大脑功能和行为的影响。此外，还需要更稳健的临床试验来确定补充产GABA的细菌菌株（如Lbr-6108）是不是能够干扰由GABA能信号介导的行为，如压力和焦虑。开发像Lbr-6108这样的菌株作为心理生物来调节神经兴奋-抑制平衡、调节情绪、认知功能、学习和记忆过程，可能有希望作为心理健康管理的补充补救措施。

  本文由“健康号”用户上传、授权发布，以上内容（含文字、图片、视频）不代表健康界立场。“健康号”系信息发布平台，仅提供信息存储服务，如有转载、侵权等任意的毛病，请联系健康界（）处理。

  brevis,GABA,ATCC,MRS,GAD,MSG,操纵子,谷氨酸,培养基,氨基,酸性,丁酸,代谢,菌株